1 利妥昔單抗的SEC分析 (LW-803)

使用水溶性SEC(GFC)色譜柱PROTEIN LW-803分析市售的利妥昔單抗(抗CD20單克隆抗體)制劑，確認(rèn)除mAb以外，也有可能是寡聚體（凝集體）或衍生自mAb的片段(分解產(chǎn)物)的色譜峰。使用兩根色譜柱串聯(lián)分析時(shí)，確認(rèn)存在保留時(shí)間和單體非常接近的片段。由于LW-803提升了對(duì)于與IgG接近的分子量領(lǐng)域的分離性能，不僅能分離抗體生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的高分子凝集體雜質(zhì)，也能在片段管理上發(fā)揮作用。
※凝集體和單體的分離一般使用一根色譜柱即可，如需分離分解產(chǎn)物使用兩根色譜柱串聯(lián)效果更好。
                                               
Sample : 20 µL
Rituximab formulation
(Injection solution)
1. Aggrigates
2. Monomer
3. Citrate

Column: Shodex PROTEIN LW-803 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Eluent: 50 mM Sodium phosphate buffer (pH7.0) + 0.3 M NaCl

Flow rate: 1.0 mL/min

Detector: UV (280 nm)

Column temp.: 25 ℃

2 利妥昔單抗的胰蛋白酶消化分析 (C18U 2D)

肽圖分析是生物類(lèi)藥物的確認(rèn)試驗(yàn)之一。所謂肽圖分析，即生物類(lèi)藥物經(jīng)由酶消化使得肽裂解為小片段，通過(guò)反相色譜分離，進(jìn)行一級(jí)構(gòu)造分析。用于UHPLC的硅膠反相色譜柱C18U系列是使用亞微米有機(jī)二氧化硅雜化顆粒作為填料，具有優(yōu)秀分離度和機(jī)械強(qiáng)度的色譜柱。以下應(yīng)用利用C18U系列色譜柱的高分離性能，使用C18U 2D分析抗體藥物的胰蛋白酶消化物，確認(rèn)了各種消化肽的峰?？贵w藥物的胰蛋白酶消化物是市售的利妥昔單抗（抗CD20單克隆抗體）制劑通過(guò)固定化胰蛋白酶的蛋白質(zhì)消化試劑盒進(jìn)行酶消化取得的。
Sample: 5 μL
Tryptic digest of Rituximab formulation
(Injection solution)
0.5 mg/mL

Column: Shodex C18U 2D (2.0 mm I.D. x 150 mm)

Eluent: (A); 0.1 % TFA in H2O (B); 0.1 % TFA in CH3CN

Linear gradient: (B %) 10 to 40 % (0 to 25 min), 40 % (25 to 30 min), 90 % (30 to 35 min)

Flow rate: 0.2 mL/min

Detector: UV (220 nm) (small cell volume)

Column temp.: 40 ℃

3 曲妥珠單抗電荷變異分析 (SP-FT 4A)

由于抗體藥物是使用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的，因此由于蛋白質(zhì)翻譯后的修飾，會(huì)導(dǎo)致其異質(zhì)性。為了保持生物藥物質(zhì)量，必須保持異質(zhì)性的穩(wěn)定。異質(zhì)性的變化會(huì)影響藥物功能，因此必須進(jìn)行各種質(zhì)量特性分析。其中之一是電荷變體（電荷異構(gòu)體）分析。嚴(yán)格控制單克隆抗體的特征非常重要，單克隆抗體因?yàn)橥ǔ?huì)由于天冬氨酸殘基的脫酰胺作用和H鏈中C端賴(lài)氨酸殘基的未加工而觀察到電荷變異，所以對(duì)其配置文件的管理非常重要。以下是使用無(wú)孔型填料的強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱IEC SP-FT 4A分析市售曲妥珠單抗制劑的應(yīng)用實(shí)例。流動(dòng)相使用增加NaCl濃度的梯度條件，和一般弱陽(yáng)離子交換柱相比，電荷變異體的分離度更高，分析時(shí)間更短。

Sample: 5 μL
Trastuzumab formulation 5 mg/mL (in H2O)

Column：

(1) Shodex IEC SP-FT 4A (4.6 mm I.D. x 10 mm; 2.7 μm)

(2) Weak cation exchange column from other manufacturer (4.0mm I.D. x 250mm; 10 μm)

Eluent：

(A); 20 mM *MES buffer (pH7.0),

(B); (A) + 0.5 M NaCl   *MES : 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid
Low pressure linear gradient;
(1) B % = 0 % to 10 % (10 min)  

(2) B % = 0 % to 20 % (20 min)

Flow rate：

(1) 0.5 mL/min  

(2) 1.5 mL/min

Detector：UV (280 nm)

Column temp.：40 ℃

4 多克隆抗體的SEC分離比較（LW-803，KW-803等）

使用水溶性SEC(GFC)用色譜柱PROTEIN LW-803和原先產(chǎn)品（KW-803）以及一般產(chǎn)品分析多克隆抗體（人血清中的IgG）。LW-803使用了適合分析幾十萬(wàn)分子量蛋白質(zhì)的孔徑，特別是分子量16萬(wàn)的γ－球蛋白分析效果變好。這部分分離性能提升特別適用于進(jìn)行抗體醫(yī)藥品IgG的單體、二倍體的分離。

Sample : 5 μL
IgG from human serum 10 mg/mL
1. Aggregates
2. Dimer
3. Monomer

Columns:

Shodex PROTEIN LW-803 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Shodex PROTEIN KW-803 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Eluent: 50 mM Sodium phosphate buffer (pH7.0) + 0.3 M NaCl

Flow rate: 1.0 mL/min

Detector: UV (280 nm)

Column temp.: Room temp.

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